• 试验七_植物DNA的提取与纯度占定

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      实验七_植物DNA的提取与纯度鉴定_理学_高等教育_教育专区。分子生物学实验

      实验七 植物DNA的提取与纯度鉴定 的提取与纯度鉴定 植物 谢 艳 ? ? ? ? ? ? ? 实验目的 实验原理 实验材料 实验试剂 实验仪器 实验步骤 注意事项 实验目的 ? 了解植物总 了解植物总DNA提取的原理 提取的原理 ? 学习和掌握提取、纯化高等植物总DNA的 学习和掌握提取、纯化高等植物总 掌握提取 的 方法和步骤 核酸的理化性质 DNA和RNA都是极性化合物,一般都溶于水或 和 都是极性化合物, 都是极性化合物 一般都溶于水或1mol/L的NaCl 的 溶液中,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 溶液中,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。核酸的钠盐比游离酸易 溶于水, 钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为 在水中为10g/L, 溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达 钠盐在水中溶解度可达 。 在水中为 , 呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中, 易水解, 呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或 、 易水解 弱碱性溶液中较稳定。 弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。 DNP在 形式存在。 天然状态的 形式存在 在 盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。 盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液 在低浓度盐溶液 几乎不溶解,如在0.14 mol/L的氯化钠中溶解度最低,仅为 的氯化钠中溶解度最低, 中,几乎不溶解,如在 的氯化钠中溶解度最低 在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加, 在水中溶解度的 ,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至 1mol/L氯化钠中的溶解度很大,比纯水高 倍。 氯化钠中的溶解度很大, 氯化钠中的溶解度很大 比纯水高2倍 背景知识 1 不同生物须选择不同DNA提取方法 提取方法 不同生物须选择不同 不同生物( 植物、 动物、 微生物) 不同生物 ( 植物 、 动物 、 微生物 ) 的基因组 DNA的提取难易度不同: 的提取难易度不同: 的提取难易度不同 对于低等生物,如从病毒中提取DNA比较 对于低等生物,如从病毒中提取 比较 容易,多数病毒DNA分子量较小,提取时易保 分子量较小, 容易,多数病毒 分子量较小 持其结构完整性。 持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一 难度大一 从细菌及高等动植物中提取 细菌DNA 分子量较大,一般达 ×10 道尔 分子量较大,一般达2× 些。细菌 因此易被机械张力剪断。细菌DNA,除核 顿。因此易被机械张力剪断。细菌 , DNA 外,还有质粒 还有质粒DNA 等。 背景知识 2 同一生物不同部位DNA含量不同 含量不同 同一生物不同部位 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要 分子在生命代谢中的作用, 为了研究 分子在生命代谢中的作用 从同一生物的不同的部位提取DNA。但由于 从同一生物的不同的部位提取 。但由于DNA分 分 子在生物体内的分布及含量不同, 子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材 料提取DNA。 料提取 。 如动植物中, 小牛胸腺、 动物肝脏、 鱼类精子; 如动植物中 , 小牛胸腺 、 动物肝脏 、 鱼类精子 ; 植物 种子的胚中都含有丰富的DNA。 种子的胚中都含有丰富的 。 如微生物中, 谷氨酸菌体含7%-10%, 面包酵母含 如微生物中 , 谷氨酸菌体含 , 面包酵母含4%, , 啤酒酵母含6%,大肠肝菌含9%-10%。 啤酒酵母含 ,大肠肝菌含 。 背景知识 3 提醒 不同种类或同一种类的不同组织因其细 胞结构及所含的成分不同, 胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差 在提取某种特殊组织的DNA时必须参照 异。在提取某种特殊组织的 时必须参照 文献和经验建立相应的提取方法, 文献和经验建立相应的提取方法,以获得可 用的DNA大分子 大分子, 用的DNA大分子,尤其是组织中的多糖和酚 类物质对随后的酶切、 类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的 反应等有较强的 抑制作用, 抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取 基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。 基因组 时 应考虑除去多糖和酚类物质。 背景知识 4 真核细胞基因组提取的方法 DNA提取基本方法: 提取基本方法: 提取基本方法 1. 机械法破碎细胞 2. 去除蛋白质,酚类等细胞内杂质污染 去除蛋白质, 3. 纯化DNA 纯化DNA ? ? ? ? ? 浓盐法 离子去污剂法 苯酚抽提法 水抽提法 CTAB法 法 CATB法的简析 法的简析 ? ? ? ? ? ? ? 冷冻和研磨, 冷冻和研磨,使细胞破裂 加入CTAB提取缓冲液,溶解 提取缓冲液, 加入 提取缓冲液 溶解DNA 氯仿/异戊醇抽提 异戊醇抽提, 氯仿 异戊醇抽提,去除蛋白 加入无水乙醇/异丙醇 沉淀DNA 异丙醇, 加入无水乙醇 异丙醇,沉淀 酒精冲洗, 酒精冲洗,去除剩余杂质 RNase消化,去除 消化, 消化 去除RNA 无菌水/TE溶解,保存 溶解, 无菌水 溶解 保存DNA CTAB法实验原理 法实验原理 ? 离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵 (hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为 , CTAB)、十二烷基硫酸钠 、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, , 简称SDS)等可以有效裂解植物细胞壁,且与 等可以有效裂解植物细胞壁,且与DNA 简称 形成可溶于高盐溶液的复合物, 形成可溶于高盐溶液的复合物,当降低盐浓度时 DNA又可沉淀析出,从而与蛋白质及多糖等分离。 又可沉淀析出,从而与蛋白质及多糖等分离。 又可沉淀析出 具体 ? CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细 、 等离子型表面活性剂能溶解细 胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚, 胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使 DNA得以游离出来。再加入苯酚 / 氯仿等 得以游离出来。 得以游离出来 有机溶剂,使蛋白质变性, 有机溶剂,使蛋白质变性,并使抽提液分 因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经 水溶性很强, 相,因核酸 、 水溶性很强 离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大 部分蛋白质。 部分蛋白质。上清液中加入异丙醇 / 无水乙 醇使DNA沉淀,沉淀 沉淀, 溶于TE或水溶液 醇使 沉淀 沉淀DNA溶于 或水溶液 溶于 即得植物总DNA溶液。 溶液。 中,即得植物总 溶液 实验材料 ? 烟草嫩叶 实验仪器和设备 研钵、研棒、水浴锅、 研钵、研棒、水浴锅、高速冷冻离心机 移液器及配套吸头、 移液器及配套吸头、50ml&10ml量筒 & 量筒 1.5ml离心管 、 50mL离心管 离心管 离心管 实验试剂及其配置 1. CTAB抽提液 (要求配 抽提液 要求配100mL) ) 试剂 CTAB 1 M pH 8.0 Tris·Cl 0.5 M pH 8.0 EDTA NaCl 需要量/L 需要量 20 g 100 mL 40 mL 82 g 终浓度 2%( ) %(w/v) %( 100 mmol/L 20 mmol/L 1.4 mol/L 实验试剂及其配置 2 1 M pH 8.0 Tris·Cl(已有不用配置) (已有不用配置) 121 g Tris碱溶于 碱溶于800 mL dd H2O,浓HCl调pH至8.0,补dd H2O定容 碱溶于 , 调 至 , 定容 至1000 mL。 。 注意: 缓冲液的pH值随温度变化较大 注意:Tris缓冲液的 值随温度变化较大,每1℃可引起大约 缓冲液的 值随温度变化较大, ℃可引起大约0.028 pH单位的变化。 单位的变化。 单位的变化 实验试剂及其配置 3 0.5 M pH 8.0 EDTA (乙二胺四乙酸 ) (要求配100mL) 要求配 ) 29.22 g EDTA溶于 溶于140 mL水中,用固体 水中, 溶于 水中 用固体NaOH 定容至200 mL。 调pH至8.0,补ddH2O定容至 至 , 定容至 。 作用: 螯合二价离子, 酶的活性, 作用:EDTA螯合二价离子,抑制 螯合二价离子 抑制DNA 酶的活性,保护 DNA 实验试剂及其配置 4 CTAB/NaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl) 要求配50mL) (要求配 ? ? ? ? CTAB NaCl 20 g 8.2 g 加入160 mL ddH2O,加热至 ℃溶解,补dd 加入 ,加热至65℃溶解, H2O定容至 定容至200 mL,高压灭菌。 定容至 ,高压灭菌。 注意:此溶液很粘稠,使用时需加热至 ℃ 注意:此溶液很粘稠,使用时需加热至65℃。 实验试剂及其配置 ? 5 3 M NaAC pH 5.2 (要求配 要求配50mL) ) ? 81.62 g NaAC·3H2O / 49.22 g 无水 无水NaAC溶于 溶于 160 mLddH2O中,冰乙酸调 至5.2,定容至 中 冰乙酸调pH至 , 200 mL,高压灭菌。 ,高压灭菌。 ? 作用:Na离子中和 作用: 离子中和 离子中和DNA分子上的负电荷,减少 分子上的负电荷, 分子上的负电荷 减少DNA分子 分子 同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀, 钠盐沉淀, 同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成 钠盐沉淀 使沉淀更完全。 使沉淀更完全。 实验试剂及其配置 ? 6 高盐 溶液(pH 8.0) (要求配 高盐TE溶液( 溶液 ) 要求配50mL) ) 试剂 1 M pH 8.0 Tris·Cl 0.5 M pH 8.0 EDTA NaCl 需要量/L 需要量 10 mL 0.2 mL 58.5g 终浓度 10 mmol/L 0.1 mmol/L 1 mol/L 作用: 作用:DNA保存更稳定 保存更稳定 实验试剂及其配置 ? 7 24:1的氯仿(三氯甲烷)/异戊醇 (要 的氯仿( : 的氯仿 三氯甲烷) 异戊醇 求配50mL) 求配 ) 氯仿变性蛋白质, 氯仿变性蛋白质,异戊醇消除气泡 注意:混匀过程要轻柔,以免DNA断裂 断裂。 注意:混匀过程要轻柔,以免DNA断裂。 要求配50mL) ? 8 75% 乙醇 (要求配 ) 实验步骤(1) ? 1、 CTAB抽提液 ℃预热;异丙醇-20℃预冷; 、 抽提液65℃预热;异丙醇- ℃预冷; 抽提液 ? 2、 称取新鲜烟草叶片 克,加液氮研磨,共加 次液氮; 、 称取新鲜烟草叶片1克 加液氮研磨,共加3-4次液氮 次液氮; ? 注意: 注意: ? (1) 研磨时应注意防止液氮冻伤,戴上一次性 手套; 研磨时应注意防止液氮冻伤,戴上一次性PE手套 手套; ? (2) 新鲜的本氏烟较易磨碎,加液氮3-4次;杂草样品特别是 新鲜的本氏烟较易磨碎,加液氮 次 不新鲜的杂草样品常较难磨,加液氮4-5次 一般加液氮4次 不新鲜的杂草样品常较难磨,加液氮 次。一般加液氮 次; ? (3) 加液氮时动作轻柔,否则液氮会将样品冲出而造成样品 加液氮时动作轻柔, 损失; 损失; ? (4) 磨样过程中,样品不能溶化,样品研磨得越细越好; 磨样过程中,样品不能溶化,样品研磨得越细越好; ? (5) 每换一个新样品,要换一次 手套。 每换一个新样品,要换一次PE手套 手套。 实验步骤(2) ? 3、 最后一次加液氮磨样后,立即加入预热的 、 最后一次加液氮磨样后,立即加入预热的CTAB抽提 抽提 抽提液, 液,每克叶片加入8 mL CTAB抽提液,再加入 每克叶片加入 抽提液 再加入160 ?L 2- - 巯基乙醇(2-Me)(终浓度2%( ))。继续研磨待 巯基乙醇( )(终浓度 %(v/v))。继续研磨待 )(终浓度 %( ))。 CTAB抽提液溶化后,将研磨液转入50 mL离心管; 抽提液溶化后,将研磨液转入 离心管; 抽提液溶化后 离心管 ? 4、 65℃水浴锅温浴 、 ℃水浴锅温浴0.5-1小时,每10-20分钟摇动一次离心 小时, 小时 分钟摇动一次离心 管;同时65℃预热 同时 ℃预热CTAB/NaCl; ; 注意:离心管盖子应轻轻搭在管口,千万不能盖紧, 注意:离心管盖子应轻轻搭在管口,千万不能盖紧, 以防加热使盖子冲出,最好离心管壁和盖子同时做好标记。 以防加热使盖子冲出,最好离心管壁和盖子同时做好标记。 实验步骤(3) ? 5、 加入等体积(约8 mL)24:1的氯仿 异戊醇抽提; 、 加入等体积( 的氯仿/异戊醇抽提 ) : 的氯仿 异戊醇抽提; ? 注意事项: 注意事项: ? (1)氯仿 异戊醇有毒,应戴上 手套操作且保持室内通 异戊醇有毒, )氯仿/异戊醇有毒 应戴上PE手套操作且保持室内通 风。 ? (2)1 mL移液枪吸取氯仿 异戊醇时,应缓吸缓放,严禁 移液枪吸取氯仿/异戊醇时 ) 移液枪吸取氯仿 异戊醇时,应缓吸缓放, 枪头朝上以防氯仿/异戊醇倒灌进枪管而腐蚀枪杆 异戊醇倒灌进枪管而腐蚀枪杆。 枪头朝上以防氯仿 异戊醇倒灌进枪管而腐蚀枪杆。 ? (3)加入氯仿 异戊醇,盖紧盖子,按紧离心管两端,上 异戊醇, )加入氯仿/异戊醇 盖紧盖子,按紧离心管两端, 下颠倒4-6次 松手后立即打开盖子,防止管内液体冲出。 下颠倒 次,松手后立即打开盖子,防止管内液体冲出。 实验步骤(4) ? 6、 天平平衡离心管,4℃ 10000 rpm 离心 分钟; 离心5分钟 分钟; 、 天平平衡离心管, ℃ ? 7、 回收水相,将上清小心地转入另一50 mL离心 、 回收水相,将上清小心地转入另一 离心 管(约8mL); ); 注意事项:水相底部有大量杂质, 注意事项:水相底部有大量杂质,用移液枪转移 水相时应细致耐心,不能吸入杂质; 水相时应细致耐心,不能吸入杂质; ? 8、 加入 体积( )、65℃ 、 加入1/10体积(800 ?L)、 ℃预热的 体积 )、 CTAB/NaCl,混匀。CTAB/NaCl 较粘 稠,可将 ,混匀。 枪尖剪去后吸取; 枪尖剪去后吸取; ? 9、 加入等体积(8 mL)氯仿 异戊醇二次抽提, 异戊醇二次抽提, 、 加入等体积( )氯仿/异戊醇二次抽提 注意事项同步骤5; 注意事项同步骤 ; ? 10、平衡离心管后,4℃ 10000 rpm 离心 分钟; 离心5分钟 分钟; 、平衡离心管后, ℃ 实验步骤(5) ? 11、回收水相,将上清小心地转入另一 mL离心 、回收水相,将上清小心地转入另一50 离心 ),注意事项同步骤 管(约8mL),注意事项同步骤 ; ),注意事项同步骤7; ? 12、加入 、加入1/10体积(800 ?L)3 M NaAC,混匀; 体积( 体积 ) ,混匀; ? 13、加入等体积(8 mL)- ℃预冷的异丙醇,- 、加入等体积( )-20℃预冷的异丙醇,- )- 20℃放置 小时; ℃放置0.5-1小时; 小时 ? 14、4℃ 12000 rpm 离心 分钟; 、 ℃ 离心15分钟 分钟; ? 15、弃上清,2 mL 75%乙醇洗涤沉淀一次; 、弃上清, %乙醇洗涤沉淀一次; 实验步骤(6) ? 16、12000 rpm 离心 分钟,轻轻地吸出 %乙 6 离心2分钟 轻轻地吸出75% 分钟, 醇,将离心管反扣在干净的吸水纸上将乙醇吸干; 将离心管反扣在干净的吸水纸上将乙醇吸干; 注意: 注意:枪头不要吸到沉淀 ? 17、37℃ 烘干 分钟; 7 ℃ 烘干10-15分钟; 分钟 注意: 烘干过程中应注意观察, 注意:DNA烘干过程中应注意观察,以DNA较 烘干过程中应注意观察 较 饱满且四周见不到明显的水滴为宜, 饱满且四周见不到明显的水滴为宜,如DNA呈纸 呈纸 状贴在管壁上,则烘干过分,会造成DNA难以溶 状贴在管壁上,则烘干过分,会造成 难以溶 解; ? 18、加入 TE溶液溶解 溶液溶解; 8 加入200-500 ?L TE溶液溶解; 注意: 难溶, 注意:如DNA难溶,可37℃水浴数分钟; 难溶 ℃水浴数分钟; 实验步骤(7) ? 19、加入2 ?L RNAase(10?g/?L)3~4 19、加入 ( ? ? ) 分钟; ?L,混匀, 37℃水浴消化 分钟; ,混匀, ℃水浴消化30分钟 注意:所提DNA可用于 可用于Southern杂交,如仅用于 杂交, 注意:所提 可用于 杂交 PCR扩增,此步骤可省; 扩增, 扩增 此步骤可省; ? 20、DNA 纯度鉴定 0 植物DNA的纯度鉴定 的纯度鉴定 植物 ? 提取得到的 提取得到的DNA一般可以用作 一般可以用作Southern, 一般可以用作 RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同 等分析。 、 等分析 由于所用材料的不同, 得到的DNA产量及质量均不同 有时 产量及质量均不同,有时 得到的 产量及质量均不同 有时DNA中含 中含 有酚类和多糖类物质,会影响酶切和 会影响酶切和PCR的效 有酚类和多糖类物质 会影响酶切和 的效 所以获得基因组DNA后,均需检测 均需检测DNA的 果。所以获得基因组 后 均需检测 的 产量和质量 植物DNA的纯度鉴定方法(1) 的纯度鉴定方法( ) 植物 的纯度鉴定方法 1. DNA溶液稀释 溶液稀释20-30倍后,紫外分光光度计测定 倍后, 溶液稀释 倍后 紫外分光光度计测定 OD260 /OD280 比值 明确 比值, 明确DNA的含量和质量; 的含量和质量; 的含量和质量 原理:核酸在 原理:核酸在260nm处有最大吸收峰 处有最大吸收峰 蛋白质在280nm处有最大吸收峰 蛋白质在 处有最大吸收峰 盐和小分子在230nm处有最大吸收峰 盐和小分子在 处有最大吸收峰 OD260/OD280= 1.7-1.9 OD260/OD2302.0 1OD260=50 ?g/mL DNA 1.6 蛋白质含量过高; 蛋白质含量过高; 2.0样品中污染 样品中污染RNA,或DNA降解 样品中污染 , 降解 植物DNA的纯度鉴定方法(2) 的纯度鉴定方法( ) 植物 的纯度鉴定方法 2. 取2-5?l 在0.8% agarose胶上电泳 检测 胶上电泳, 的分子大小; 8 胶上电泳 检测DNA的分子大小; 的分子大小 DNA样品在 样品在0.8% Agarose胶上电泳(例图) 胶上电泳( 样品在 胶上电泳 例图) 植物DNA的纯度鉴定方法(3) 的纯度鉴定方法( ) 植物 的纯度鉴定方法 ? 3. 取2?g DNA, 用10单位 单位HindⅢ酶切过夜 0.7% agarose胶 单位 Ⅲ酶切过夜, 胶 上电泳, 检测能否完全酶解( 上电泳 检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶 , 必须完全酶 解)。 ? 如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA 如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA 中所含杂质多 影响后续的分析和操作,可以用下列方法处理: 多,影响后续的分析和操作,可以用下列方法处理: ? (1)选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量; )选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量; ? (2)酚:氯仿抽提 去除蛋白质和多糖; 氯仿抽提, ) 氯仿抽提 去除蛋白质和多糖; ? (3)柱子过滤 去除酚类、多糖和小分子 )柱子过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA; ; ? (4)氯化铯梯度离心 去除杂质 分离大片段 )氯化铯梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用 ( 作文库构建)。 作文库构建)。 试验要求 凝胶电泳鉴定植物DNA的纯度 的纯度 凝胶电泳鉴定植物 ? 取2-5?l 在0.8% agarose胶上电泳 检测 胶上电泳, 8 胶上电泳 检测DNA的分 的分 子大小及纯度 1 每组配制 8% agarose胶1块; 每组配制0.8 胶 块 2 取3ul DNA抽提液上样,电泳半小时; 抽提液上样, 抽提液上样 电泳半小时; 3 紫外下观察结果

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    2019-11-07 01:01